利用酶解法测定复合维生素溶液中维生素A含量的研究

发布时间:2010-07-27 来源:东方澳门新葡8455·研发部


利用酶解法测定复合维生素溶液中维生素A含量的研究
赵小华,吴桂英,寇贺红*,郑彦丽,赵桂廷
澳门新葡8455,广东,佛山,528234
 
摘要: 目的:建立碱性蛋白酶---高效液相色谱法测定复合维生素溶液中维生素A的含量。方法:利用碱性蛋白酶的方法处理样品,并采用EcoSic  HPLC Coumw-ODS,C18柱(4.6×200mm,5µm)分离,检测波长326nm,流动相为甲醇+水(95+5)等高效液相色谱条件检测样品中维生素A的含量。结果:样品中维生素A与其他组分分离良好,维生素A浓度在120-600IU/mL范围内线性良好(r=0.9997),平均回收率在(n=5)99.9%,RSD为1.0%。结论:本方法简便、快捷、结果准确、可靠、重现性好,可做为企业控制生产过程中复合维生素溶液质量的方法之一。
关键词:碱性蛋白酶、高效液相、复合维生素溶液、维生素A
*通讯作者:寇贺红,电子邮箱: kouhehong@126.com,电话: 0757-85238996-812
 
Abstract: Purpose: Vitamin A content in multi-vitamin solution was detected by establishing alkaline protease and High Performance Liquid Chromatography(HPLC) method. Methods: The samples were detected by alkaline protease and detected Vitamin A content by the HPLC Conditions of EcoSic HPLC Coumw-ODS,C18 separation column (4.6×200mm,5μm),326nm detection wavelength and methanol+water (95+5) mobile phase. Results: The separation of vitamin A and other components in the sample was good, the linearity of vitamin A concentration in the range of 120-600IU/mLwas good (r = 0.9997),and average recoveries 99.9% (n = 5), RSD 1.0%. Conclusions: The detection method was simple, quick, accurate, and can be used as the method of control the multi-vitamin production quality.
Key words: Alkaline protease,HPLC, multi-vitamin solution, vitamin A
Corresponding author: Kou He-hong(kouhehong@126.com , 0757-85238996-812)
 
    维生素A(Vitamin A) 又称视黄醇,是1913年美国化学家台维斯从鳕鱼肝中提取得到一种不溶于水,易溶于脂肪、油等有机溶剂的黄色粉末。其主要生理功能包括:维持视觉、促进生长发育、维持上皮结构的完整与健全、加强免疫能力、清除自由基等[1]。因此常作为补充动物营养、提高生产性能的维生素之一。1999年国家质量技术监督局颁布了国家标准---饲料中维生素A的测定适用于复合维生素预混料中维生素A的测定[2]。由于饲料中成分复杂,样品前处理需要经过一系列的皂化、提取、浓缩等方法处理,最后采用高效液相色谱法测定维生素A含量虽堪称经典方法,但是由于复合维生素预混料成分相对简单,再利用该法控制质量,其操作过程不仅费时费力,而且检测结果的精确性还与检测人员实验技能操作熟练程度有关。因此国内饲料添加剂企业想通过寻找一种简便、快捷、可靠的方法测定复合维生素预混料中维生素A的含量。
    1. 仪器与试药
    1.1 仪器与色谱条件  高效液相色谱仪:Agilent Technologies 1200series。色谱条件:色谱柱EcoSic  HPLC Coumw-ODS,C18柱(4.6×200mm,5µm)检测波长326nm,流动相为甲醇+水(95+5)[2],流速为2.0mL/L,进样量为10µL,柱温35℃。万分之一分析天平:Sartorius Bs224s。
    1.2 试药  对照品:维生素A乙酸酯:批号K0210906, 100万IU/mL,中国兽药监察所;碱性蛋白酶:批号090926,10万IU/g,浙江海宁金潮实业有限公司;复合维生素溶液(主要成分为维生素A、D、E,标示量分别为12000IU/mL、8000IU/mL、8IU/mL):批号091030、091108、091125,澳门新葡8455;空白样品(不含主要成分的复合维生素溶液,自制);10%氨水溶液(自制);纯化水(自制);无水乙醇(分析纯);甲醇(色谱纯)。
    2. 方法和结果
    2.1 对照品溶液的制备  精密称定对照品(维生素A乙酸酯)60mg置100mL的棕色容量瓶中,精密量取10mL的10%氨水溶液置棕色容量瓶中,在加50mL的无水乙醇,超声使其溶解,再精密称定碱性蛋白酶1g加入到棕色容量瓶中,振摇,用无水乙醇稀释至刻度后在超声10min,先用滤纸过滤,再用微孔滤膜(0.45µm)过滤,取过滤液即得。
    2.2 供试品溶液的制备  精密量取复合维生素溶液5mL到100mL棕色容量瓶中,精密量取10mL的10%氨水溶液置棕色容量瓶中,在加50mL的无水乙醇,超声使其溶解,再精密称定碱性蛋白酶1g加入到棕色容量瓶中,振摇,用无水乙醇稀释至刻度后在超声10min),先用滤纸过滤,再用微孔滤膜(0.45µm)过滤,取过滤液即得供试品溶液。
    2.3 对照品、供试品的HPLC图谱  见图1(A、B)  

图1(A) 对照品维生素A乙酸酯的HPLC图谱 

图1(B) 复合维生素溶液中维生素A的HPLC图谱 
    2.4 空白实验 精密量取空白样品5mL,分别按照2.2项方法处理样品,结果见图2。结果显示空白样品对该系统没有干扰。

图2  空白样品的HPLC图谱
    2.5 线性关系考察   精密称取2.1项下对照品溶液1、2、3、4、5µL分别注入液相色谱仪,以色谱峰面积(Y)为纵坐标,进样量(µL,X)为横坐标绘制维生素A乙酸酯标准曲线,并得出回归方程 Y=230.2X+48.4(R=0.9997),维生素A乙酸酯在120-600IU/mL的范围呈良好线性关系,标准曲线见图3。

图3 对照品维生素A乙酸酯标准曲线
    2.6 精密度实验  精密吸取对照品溶液10µL,连续进样5次测定其峰面积,根据连续进样5次测定的峰面积,计算出RSD=0.40%。
    2.7 稳定性实验 取同一批号供试品溶液按2.3项下色谱条件 0min、10min、20min、30min、50min、1h、2h 进样,分别测定其峰面积(见表1)。经过在不同时间点测定样品的峰面积值,结果表明样品在2小时内无明显的变化,说明实验过程中样品的稳定性良好。
表1 供试品稳定性实验结果
时间(min )
峰面积
平均峰面积
RSD(%)
0
2456
2446
0.5
10
2446
20
2460
30
2445
50
2454
60
2440
120
2423
    2.8 重现性考察   精密量取同一批号供试品5mL共6份,按照2.2项下制备供试品溶液,和1.1项下色谱条件测定维生素A的含量,结果见表2。
表2 供试品重现性考察结果
序号
峰面积
含量(%)
平均含量(%)
RSD(%)
1
2005.8
98.16
98.2
0.73%
2
2006.7
98.21
3
2005.2
98.13
4
2032.2
99.46
5
2032.2
99.46
6
2033.3
99.51
    通过连续六次测定样品的峰面积值,利用对照品比值法计算出的结果表明重现性良好。
    2.9 回收率实验  精密量取复合维生素溶液5mL,添加已知准确含量的维生素A乙酸酯原料0.06g(精确至0.0002g),测定其回收率,结果见表3。
表3 维生素A乙酸酯回收率实验结果
编号
投料量(g)
测得量(g)
回收率(%)
平均回收率(%)
RSD(%)
1
0.06022
0.06021
99.98
99.9
1.0
2
0.06012
0.06010
99.97
3
0.05911
0.05901
98.37
4
0.05999
0.06012
100.05
5
0.05986
0.06050
101.07
    由上表可知样品的平均回收率为99.9%(RSD=1.0%),说明通过酶解法测定复合维生素溶液中维生素A具有良好的回收率。
    2.10 样品含量测定  分别精密量取三个批号的供试品各5mL和对照品(维生素A乙酸酯)60mg,分别按照2.2项和2.1项方法制备供试品溶液和对照品溶液,并按照1.1项下色谱条件检测维生素A的含量,结果见表4。
表4 三批供试品中维生素A含量的测定结果 
批次
平均含量(%)
091030
99.45
091108
98.30
091125
99.09
    3 讨论
    3.1 测定方法的选择  复合维生素预混料的传统检测方法样品前处理需要经过一系列的皂化、提取、浓缩等方法处理,最后采用高效液相色谱法测定维生素A含量虽堪称经典方法,但是其操作过程不仅费时费力,而且检测结果的精确性还与检测人员实验技能操作熟练程度有关。参考郭芙蓉等[3]和蒋一昕[4,5]的研究方法和维生素A乙酸酯微粒的检测方法[6],并经过长期不断的实践,结果发现采用碱性蛋白酶酶解处理复合维生素预混料后,采用高效液相色谱法测定维生素A含量不仅简便快捷,而且结果准确、可靠。 
    3.2 样品处理  在实验过程中,所有样品前处理首先用10%氨水溶液与50ml的无水乙醇溶解,并且一定要等待样品完全溶解后再加碱性蛋白酶,如果过早加入碱性蛋白酶,会使得碱性蛋白酶与样品包粘在一起,而导致酶解不完全。
    3.3 碱性蛋白酶  样品处理过程中碱性蛋白酶的添加量与取样量中维生素A的含量有一定的关系,即碱性蛋白酶的添加量(万IU)与取样量中维生素A的标示量(万IU)比值不得少于10/6。如果取样量中维生素A的标示量异常高时,碱性蛋白酶的添加量应为常规添加量的两倍以上,这样才能保证碱性蛋白酶使样品完全酶解。
    3.4 波长的选择  根据HPLC扫描的三维立体色谱图(波长在200-500nm)显示维生素A有吸收,结合等吸收图和图1(A、B)综合考虑,确定在326nm处作为复合维生素溶液的检测波长。
    4 小结
    使用碱性蛋白酶---高效液相色谱法测定复合维生素溶液中维生素A乙酸酯含量的方法简便、快捷、结果准确、可靠、重现性好,故能够更好的控制产品质量,并为饲料添加剂企业提供复合维生素预混料内部控制质量标准作参考。
 
参考文献
[1] 曹威荣,张春善.浅谈维生素A在家禽体内的代谢及营养作用[J].饲料博览,2006,(4):45-48.
[2] 中国国家标准化管理委员会.中华人民共和国国家标准GB/T 17817-1999[S].
[3] 郭芙蓉,杜红鸽. 酶解法测定饲料中维生素A、E的含量[J].河南畜牧兽医, 2006,(1):8.
[4] 蒋一昕. 酶解法测定饲料中维生素A含量[J].兽药与饲料添加剂, 2003,(6):26-27.
[5] 蒋一昕. 反相高效液相色谱法测定预混合饲料中维生素A乙酸酯的含量[J].中国兽药杂志, 2005,39(2):14-18 
[6] 中国国家标准化管理委员会.中华人民共和国国家标准GB/T 7292-1999[S].
 
*通讯作者:寇贺红,1979年生,硕士研究生,主要从事兽药制剂与饲料添加剂的研究,E-mail:kouhehong@126.com , 电话:0757-85238996-812
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