蛭弧菌的开发

发布时间:2010-07-27 来源:东方澳门新葡8455·研发部


蛭弧菌的开发

一、背景

蛭弧菌(Bdellovibrio)是寄生于其他细菌能导致其裂解的一类细菌。它虽然比通常的细菌小,能通过细菌滤器,有类似噬菌体的作用,但它不是病毒,确确实实是一类能"吃掉"细菌的细菌。1962年首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中,随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。根据其基本特性,命名为Bdellovibrio bacteriovorus。其中,"Bdello"一词来自希腊字,"水蛭"的意思,"vibrio"意为"弧菌",而种名"bacteriovorus""食细菌"的意思。由于它们具有特殊的捕食生活方式以及有可能充当决定自然界中微生物种群变动的角色,因而引起了许多科学工作者的兴趣。

二、研究的意义

水产动物细菌性病害业已成为制约我国水产养殖业持续发展的瓶颈。据报道,2003年我国爆发的细菌性病害就有几十种,而每年仅鱼类细菌性败血病造成的直接经济损失就达10亿元以上。蛭弧菌广泛存在于自然界,一般污水中含菌数105/ml,下水道污水中可含菌数达上万个/ml,土壤中含菌数103-5/g,但在干净的水体中却很难发现它们的存在。余倩和张贤良发现蛭弧菌含量与细菌总数呈正相关。当水体受到污染时,大肠杆菌、沙门氏菌等首先出现,蛭弧菌随后出现,随着水体污染程度的提高,其数量也随着增加。当水体净化澄清后,蛭弧菌数量随之下降。蛭弧菌的数量分布与水体中细菌的相关关系使得它可能作为水体污染程度的一个重要指标。

1997年杨淑专等研究海洋蛭弧菌对对虾病原菌和其他细菌的寄生作用,表明蛭弧菌不仅对各种弧菌、气单胞菌、邻单胞菌有裂解作用,而且对非海洋细菌如大肠杆菌、绿脓杆菌也有裂解作用,甚至对革兰氏阳性菌如枯草杆菌和金黄色葡萄球菌也能裂解。

蛭弧菌对鱼类常见致病菌裂解作用及对鲤感染嗜水气单胞菌预防效果的研究也进一步证明蛭弧菌对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌,且肠道病原菌更易被裂解。Pineiro等进一步对蛭弧菌的宿主范围作了研究,已证实蛭弧菌对沙门氏菌属、志贺氏菌属、变形杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、户军属中的众多菌株菌有很强的裂解能力,这充分说明了蛭弧菌噬菌谱广。

目前,随着水产养殖业的迅速发展,水质污染越来越严重,水质恶化已成为制约水产养殖发展的主要因素。而集约化程度不断提高,病害发生越来越严重,为了发展绿色无公害养殖,我国目前大多提倡使用微生态制剂代替抗生素。

陈家长(2001)将蛭弧菌应用于河蟹养殖时发现,不但使用蛭弧菌后水体中的COD,氨氮,硫化氢等都明显下降,COD维持在4.21mg/L,氨氮维持在0.24mg/L,硫化氢维持在0.006mg/L,而且使河蟹的成活率提高了13.5%,平均体重提高了30g/只。何进义等(1996)将蛭弧菌应用于鱼类细菌性疾病的防治,发现蛭弧菌对水体中的细菌和大肠杆菌去除明显,并对氨氮,亚硝酸盐有一定的去除作用,实验池的成活率也比对照池提高了19.4%-15.4%。陈家长等(2002)还将蛭弧菌与光合细菌混合使用来改善养殖环境,25天后实验组比对照组池塘中的细菌总数减少了3个数量级,COD,氨氮,硫化氢等都维持在较低的水平。

本研究主要以提高蛭弧菌的质量为目标。经过大量摸排,发现市面上所销售的蛭弧菌实际的活菌数要不达不到说明书上标明的数量,要不细菌所处的生长期参差不齐,有的细菌已处于衰败期,活力有限。Burger等发现蛭弧菌保藏的效价很不稳定,室温保藏36天后,蛭弧菌的浓度由原来的108fu/ml降低到10pfu/ml。因而有效提高蛭弧菌的质量具有了现实意义,对实现蛭弧菌在水产动物生物防病应用上的推广具有了理论意义。

三、研究的理论依据

蛭弧菌保藏方法的研究对其大规模工业化生产和实际应用尤为重要,国内外学者也对此进行了大量的探索。1963Stolp曾用含宿主细胞的YP培养基保藏蛭弧菌,Huang等用同样的方法保藏蛭弧菌,发现4-8个月内蛭弧菌仍保持一定的活性。国内学者秦生巨等在4℃条件下用自来水宿主软琼脂保藏蛭弧菌,发现其至少可以成活3个月以上;黄文等用4℃甘油、4NB液、平板、-20℃甘油和冷冻干燥等五种方法保藏蛭弧菌,发现冷冻干燥保藏法效果最好,21个月的复活率为100%,而且复活后其形态和噬菌特性不变;其次为-20℃甘油和4NB液保藏法,17个月的复活率为67%,其余的2种保藏方法保藏时间也均超过3个月。1982年司稚东等首先开展了对蛭弧菌的系统性研究,对生物学特性、培养保藏方法、生态学及污水净化等方面取得了丰硕的成果,这推动了国内学者对蛭弧菌研究工作的进一步展开,这些研究成果为蛭弧菌在水产养殖疫病防疫中的应用提供了重要的理论基础。冷冻真空干燥法和液态氮超低温度保藏蛭弧菌法是国际公认的长时、高效保存菌株的方法,但操作显得繁琐或成本较高,不适合我国微生态制剂生产厂家生产和用户的使用。但用自来水宿主软琼脂保存蛭弧菌培养物虽然简单易行,但保存效果不够理想。

四、研究的目标

销售的成品制剂在室温条件下能保持蛭弧菌活菌数大于1.0×105cfu/ml2年。

五、研究的主要内容

(一)开发快速蛭弧检测试剂盒;

(二)蛭弧菌保护液研究及产品稳定性研究;

(三)适合淡水用蛭弧菌溶液及海水用蛭弧菌溶液。

六、研究的方法

使用自来水双层检测法与平板计数法,研究了不同的保护液、保藏温度和保藏pH的选择以及不同pH调节剂对蛭弧菌长期保藏的影响。

七、研究的步骤

(一)宿主菌的制备

将试验用大肠杆菌(44102)接种到营养肉汤培养基中,37℃振荡培养24-30h4000r/min离心30min,倾去上清液,用无菌生理盐水离心清洗一次,得到浓缩大肠杆菌液,置沸水浴10min,冷却置4℃保存备用。

(二)蛭弧菌液体的制备

取蛭弧菌浓缩液加无菌生理盐水制成含活菌5.0×105cfu/ml的液体。

(三)自来水双层琼脂平板法

双层琼脂培养基:底层:1.5%琼脂,用自来水溶化,120℃高压灭菌30min,冷却至50℃左右,倒入培养皿,每皿20ml,冷却待用。上层:1.5%琼脂,用自来水溶化,120℃高压灭菌30min,放入45℃水浴锅内,加入适量宿主浓缩液,混匀,取5ml液体迅速加在底层培养基铺匀,备用。

取蛭弧菌和宿主菌悬液,用此方法检测噬菌斑,待凝固后于30℃温箱内培养48h,检测。

八、研究的主要过程

(一)蛭弧菌保藏温度的优化

将蛭弧菌液于万级条件下平均分装到三个洁净的塑料瓶中,分别置于40℃、25℃和4℃进行保藏。在保存之后的24个月内每个月用自来水双层琼脂平板法检测一次。

(二)蛭弧菌保藏液的优化

用营养牛肉膏保护液(牛肉膏3g/L;蛋白胨10g/L;氯化钠3g/L)、10%甘油保护液、10%大豆油保护液、5%葡萄糖保护液、磷酸盐缓冲液保护液、自制A保护液,全部灭菌后代替灭菌生理盐水,制成6种不同保护液保存的蛭弧菌液,置于25℃下保藏。以灭菌生理盐水保存为对照组,在保存后的1-24个月内用自来水双层琼脂平板法每月检测一次。

(三)蛭弧菌保藏pH的优化

将蛭弧菌液分别用氢氧化钠试液调节pH值为5.06.07.08.09.0,置于25℃下保藏。以灭菌生理盐水保存为对照组,在保存后的1-24个月内用自来水双层琼脂平板法每月检测一次。

(四)蛭弧菌保藏pH调节剂的优化

将蛭弧菌液分别用氢氧化钾试液、硫酸铵溶液、碳酸钠溶液调节pH值至8.0,置于25℃下保藏。以灭菌生理盐水保存为对照组,在保存后的1-24个月内用自来水双层琼脂平板法每月检测一次。

九、研究成果

(一)研究成功快速弧菌检测试剂盒

弧菌检测操作说明书

原理:弧菌显色实际只适合弧菌科菌类的显色观察。定量的被测试水样均匀涂抹在制备好的试剂板上一定时间,通过弧菌产生的酸碱显示出明显可见的颜色,通过计数,计算出水体中每毫升弧菌的数量。

操作方法:

制板方法:取一袋试剂放入烧杯中,用滴管加入2ml凉水研成均匀的糊状,冲入新烧开的沸水至60ml刻度,搅拌至全部溶解,放置不烫手时均匀倒入3个平皿中,每皿约20ml,平放,加盖,冷却至室温进行检测。

测试样操作:用滴管取水样(每个滴管用一个水样),滴加到凝固的试剂板上3滴(0.1ml),用L涂棒(每个涂棒用一个水样)均匀涂抹,加盖,平放1-2小时后倒置。室温25-371天,20-252天。

弧菌计数:显色后的试剂板上出现可见的颜色和直径有区别的显色点,是不同细菌特性的显色表现。通过计数每个平板平均显色点(X),可以计算出水样中的弧菌含量Y=X×10(个/ml)。

指标和建议:

一般养殖水体中每ml超过1000个弧菌,就很容易出现大面积发病,因此,将1000/ml作为警示指标。在合适的温度和有机质比较浓的水质中,弧菌数量由500/ml升到1000/ml往往只需要2天时间,所以,控制弧菌含量应该在500/ml或更低的时候进行。

南美白对虾在养殖40天和70天前后,投饵量迅速增加,产生大量的有机废料,超出了水体自身净化能力,给弧菌营造了适宜的营养温床,使对虾容易感染弧菌疾病,表现黑、黄鳃、黑斑等症状,会出现大量的游塘和死亡。建议在养殖过程每周检测弧菌量,当弧菌量上升至约300/ml时,使用“蛭弧菌”处理,能维持弧菌量,在较低的水平和较长的周期,每7-10天使用一次;如果超过500/ml,最好先使用消毒剂如“菌毒净”每亩200g化水泼洒,2天后使用“蛭弧菌”+“媒合益生素”维持水质。严格控制弧菌在1000/ml以下,特别是在养殖40天和70天前后,更应注意弧菌的变化,当弧菌增长过快或过高再进行以上“消毒剂”——“蛭弧菌”的一个处理过程。

注意事项:

试剂用水为蒸馏水或纯净水(可以用饮用纯净水);

溶化试剂必须是新烧开的沸水;

检测后的平板须用沸水将显色点洗掉;

平皿、滴管、L涂棒等用具经清洗、晾干,可重复使用。

根据我们研究发现,养殖池中水体质量与水体蛭弧数量有极大负相关性。蛭弧数量多,不控制,易发病,且氨氮难控制。

该快速蛭弧检测试剂盒使用十分方面,能准确知道养殖池中蛭弧数量。最重要的是提供了科学控制弧菌的有效方法!

可谓称得上“水体健康状况的一把尺子”。

推广应用以来,深受用户好评,它是成功水产养殖的好帮手。

(二)蛭弧菌保护液研究及产品稳定性研究

不同保藏温度对蛭弧菌的活性有着极大的差异,但对其外观性状没有多大的影响,其中4℃下保藏蛭弧菌液在24个月检测时含量为3.3×105cfu/ml25℃下保藏蛭弧菌液在24个月检测时含量为0.4×105cfu/ml40℃下保藏蛭弧菌液在24个月检测时含量为8.2×104cfu/ml。说明4℃保藏对蛭弧菌液的稳定性有很大的帮助,但在实际生产当中,不可能做到这点。

不同的保护液优化试验结果表明自制A保护液对蛭弧菌保藏有着非常明显的保护,24个月检测时含量为1.7×105cfu/ml。而其他的保护液也有不同程度的保护作用。其中磷酸盐缓冲液保护液优于甘油保护液,甘油保护液优于葡萄糖保护液,葡萄糖保护液优于大豆油保护液,大豆油保护液优于营养牛肉膏保护液。

不同的pH值对蛭弧菌的保护没有明显的改善。

不同的pH值调节剂对蛭弧菌的保护有一定的变化,但不明显,硫酸铵溶液最优。

经过上面的试验,最终确定我们的工艺为采用保护液A作为保护液,以硫酸铵调节pH值至8.0,室温保存。上市后的产品经检验均达到我们设计的要求。使用十分方便,且能保证质量。

(三)适合淡水用蛭弧菌溶液及海水用蛭弧菌溶液

经我们筛选,成功开发出淡水用蛭弧菌溶液,此蛭弧菌在淡水中活力及繁殖力特强,超过一般蛭弧菌10倍以上。成功开发出在海水中活力及繁殖力特强,超过一般蛭弧菌15倍以上用蛭弧菌溶液。

2008年下半年推出以来,共销售450万元,取得良好社会效益。

十、应用前景

随着抗生素引起的耐药性和残留等毒副作用日益突出,利用自然界固有的噬菌蛭弧菌控制病原菌,进行生物防治和水体净化,将成为一种有效的新式手段。但在实践中广泛应用还有许多的问题需要解决。目前我公司产品主要是针对海水和淡水养殖,使用浓度也有推荐,对养殖水体的污染程度不一致,推出不同解决良好方案。

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